10nm中的精彩：奧林巴斯全內反射顯微技術

隨著科研水平的提高和實驗技術的發展，人們對生命科學領域的探索也在不斷深入。以前，人們依靠觀察固定的組織標本，揭示了許多自然的奧秘，但是在科學技術高速發展的今天，科研人員希望在zui真實的條件下來觀察活體細胞，研究細胞表面和內部的動態變化，甚至觀察細胞內單分子的運動情況。

全內反射（total internal reflection）基本理論-Snells’ Law
全內反射現象是生活中的一種常見現象，如右下圖所示 ，當一束平面光波從折射率為n1的介質進入到折射率為n2的介質中。入射光在兩介質接觸面一部分發生反射，一部分發生折射。入射角θ1和透射角θ2之間滿足關系遵循Snells’ Law:

由Snells’ Law可知，若n1大于n2，由公式可以看出當入射角增大時，透射角也增大。假設增大到臨界角θc時的透射角為90°。當光線以大于或者等于臨界角θc入射時，入射光在界面處只發生反射而不再透射進n2介質，也就是發生了全反射。即 θ2=90° θc=sin-1(n2/n1)

由上式可知，當n1大于n2時，全反射就可能發生。如果玻璃的折射率取為1.52，溶液的折射率取為1.33(生物細胞的折射率范圍是1.33～1.38)，則玻璃/界面處的臨界角為61.74°。即當光線從玻璃中射入溶液中時，入射角大于61.74°時就會發生全反射。

消逝波（Evanescent wave）與全內反射顯微鏡 （TIRFM）
從幾何光學的角度來看,當發生全反射時,光會在玻璃界面上*反射而不進入液體溶液中。實際上,由于波動效應,有一部分光的能量會穿過界面滲透到溶液中,平行于界面傳播。這部分光就是所謂的隱失波。隱失波是一種非均勻波，它沿著入射面上的介質邊界傳播，在平行界面方向以平行波場方式傳播而在垂直界面方向則是呈指數衰減。

全內反射熒光顯微技術(TIRFM, Total Internal
Reflection Fluorecence Microscopy）又稱為消逝波顯微技術，是利用全內反射產生的消逝波激發樣品，從而使樣品表面數百納米厚的薄層內的熒光基團受到激發，因此幾乎*排除了細胞體內的自發熒光干擾。與傳統熒光照明技術相比，TIRFM技術極大的改善了圖像的信噪比從而可以觀察到樣品表面甚至單分子的活動情況。

消逝波在生物成像應用中具有以下幾點優勢較低的光損傷  
較低的光損傷
較高的Z軸分辨率 (80-300 nm)
高信噪比
熒光高對比度 
對活細胞有較低的光漂白和光毒性
結合活細胞動力學研究的方案

WF, CLSM, SDCM and TIRF技術在Z軸分辨率和獲取速度上的比較

該圖為寬場照明（wildfield，WF）成像與TIRF成像的效果對比。由于TIRF模
式下細胞只有很薄的緊貼培養皿底部的部分熒光物質被激活，所以非常細小的結
構（如actin）由于信噪比（S/N）增加而顯得特別清晰。

應用篇

TIRFM在生物學研究中的應用
1、膜相關的生物學研究
分子擴散的研究 (如 Sytaxin蛋白的研究)
轉運動力學研究
膜融合研究
細胞通訊研究
細胞骨架動力學研究
2、囊泡運輸
運輸過程的研究
分子定位研究
胞吞胞吐研究
3、單分子熒光檢測

TIRF應用示例1：微管動力學研究
生長的微管末端是許多重要蛋白暫時結合的平臺，這些蛋白可以調節微管的動態及細胞亞結構間的相互作用。末端結合蛋白（End-binding proteins (EBs)）可以自主的識別生長的微管末端的一個擴展區域，這個區域的結構特性是未知的，然后末端結合蛋白再募集其他因子到這個動態末端結構上。 

TIRFM應用示例2：膜融合變化（胞吐）
細胞也需要輸入和輸出大分子，它的大小不能直接通過孔或轉運蛋白跨膜轉運。在真核細胞中，該過程是分別通過胞吞（Endocytosis）和胞吐（Exocytosis）來實現的。

胞吞和胞吐都涉及到一種特殊的脂囊泡的形成。受體介導的胞吞開始是大分子與細胞的質膜上的受體蛋白結合，然后膜凹陷，形成一個含有要輸入的大分子的脂囊泡，也稱為內吞囊泡，出現在細胞內。出現在胞內的囊泡與胞內體融合，然后再與溶酶體融合，胞吞的物質被降解。在胞吐中，細胞分泌出的蛋白質被包裹在囊泡內，然后與質膜融合，zui后將囊泡內的包容物釋放到細胞外介質中。無論是胞吞還是胞吐過程，都有非常關鍵的一部分過程是發生在細胞膜上的，如下圖所示神經遞質的釋放過程，突觸小泡到達細胞膜區域進入消逝波范圍，通過胞吐作用釋放神經遞質到突觸后膜的過程可以完整的被記錄到。

膜融合反應(胞吐)
- 囊泡研究關注質膜融合過程 
- 胞吐過程非常迅速且信號微弱
- 高信噪比的TIRF技術成像可以捕捉該信號

該視頻顯示快速的膜融合過程，
在該反應過程中可以觀察到許多囊泡破裂后快速的熒光增加過程，隨后是緩慢的擴散。

TIRFM應用示例3：單分子定位超分辨率成像
超分辨率成像能夠量化單分子在XY層面上達高于20nm的精度，下圖顯示神經內分泌細胞膜上單個蛋白分子的分布狀態。

Dr. Colin Rickman, Heriot-Watt University 

產品篇

系統核心優勢一

Z-軸漂移補償系統(ZDC)：已經升級至第三代
連續模式:獨立工作，與成像同步進行(100Hz取樣率，每秒5次矯正)
高度:下至70納米
特殊偏移透鏡:同步Z-軸聚焦調節
高耐用度
                                        

系統核心優勢二

微秒級系統實時控制器(RTC)
高速(100µs) ，高精度(<2µs) ，系統全模塊并行實時協調控制ODB (Olympus Data Bus)數據總線，便捷穩定的通訊TTL數字信號同步輸出/輸入，可以方便搭載第三方產品可調模擬信號輸出

系統核心優勢三

實驗管理器(Experiment Manager)
基于實施控制系統（RTC）
圖像化編程
隨意創建實驗協議，直觀便捷自動保存協議和數據

系統核心優勢四

為什么在TIRF系統中，特別同步多色TIRF成像時，每個通道激光單獨引入？
在同樣的光學體系中，由于不同波長的光發生全內反射需要的臨界角不同，如果所有的激光采用單個通道引入，則會造成不同的激光產生的消逝波深度（ Penetration depth ）不同，如圖左側所示，405nm和640nm的激光產生的消逝波深度分別為132nm和83nm，無法保證TIRF觀察深度的一致性。

奧林巴斯Cell^TIRF系統，采用激光單獨引入，zui多四通道獨立控制，實線電動同步，能保證不同的激光消逝波深度保持一致，實現了空間定位的一致性和高的Z軸分辨率；如圖右所示， 405nm和640nm的激光能夠各自調整到相應的入射角度（67°和77°），保證TIRF觀察深度在83nm。

針對用戶的不同需求，OLYMPUS cell^TIRF有single line、2line、4line可供用戶選擇，通過不同的TIRF成像模式，均可以實現的TIRF成像。

系統核心優勢五

OLYMPUS TIRF物鏡種類豐富，分辨率，放大率，可選擇性，！用戶可根據自己的需求選擇。

奧林巴斯全內反射熒光顯微鏡(TIRF)系統外觀